建立神經元週期表的野望

人腦由如天文數字般的860億顆神經元(神經細胞)組成，那麼這些神經元到底有多少種呢？這些神經元的特性有沒有什麼樣的規律？

門得列夫在19世紀時提出以原子量建立元素週期表，由此週期表我們有系統性地對認識各個元素，並得以歸納、推測元素對電子的親和力、預測了當時未知的元素的存在！

來自艾倫腦科學研究所的團隊，開創性的進行「神經元週期表」的研究(圖一)，目標是解析視覺皮質的抑制性神經元，希望未來我們能藉此預測、推測神經元的性質，結果發表在期刊細胞[1]！相關細胞數據也可在Allen brain atlas中查詢(圖二)。而與此同時，來自貝勒醫學院(Baylor college medicine)的Andreas Tolias和德國杜賓根大學的Philipp Berens、瑞典卡羅林斯卡研究所的Rickard Sandberg同樣系統性的研究大腦動作皮質神經元的多樣性，結果發表在期刊自然[2]。這兩篇研究提供了一致性的結果，大腦神經元具有多樣但連續變化的型態、電生理、轉錄體(基因表達)的資訊，這三者彼此具有一定的對應關係，同時結合這三者能更好的對神經進行分類！
圖一、神經元週期表，嘗試系統性地歸納神經元的性質。

圖二、艾倫腦科學研究所的團隊在資料庫中建立了所謂的「神經細胞卡」，可以此得到大腦神經元的型態以及電生理的數據。

在DNA發現以前，1906年獲得諾貝爾獎的神經科學之父卡哈(Caja)，以共同獲獎的科學家高基(Golgi)所發明的Golgi stain進行神經元的素描，開啟了以神經元的「外型」(型態，morphology)進行分類的方法(圖三)[3]。
圖三、小腦的普金斯細胞(Purkinje cell)，具有片狀散開的樹突結構，Caja的手稿。

然而這樣的分類方法仍不能捕捉到神經元在大腦中的功能，因此在2015年Andreas Tolias和Xiaolong Jiang所帶領的團隊便在一篇引起學界筆戰的論文中[4-6](註一)，發展了同時記錄神經元電生理以及型態的方法─利用膜片鉗技術紀錄細胞的膜電位，接著注入染色劑以光學顯微鏡進行神經元外型的重建，在這篇文章中，他們以型態、電生理、連結方式等鑑別出了15種抑制性的神經元。

緊接著在2016年Andreas Tolias和Rickard Sandberg所帶領的團隊又發展出了重要的”Patch-seq”的技術[7](圖四)─在紀錄神經元電生理特性之後，萃取該細胞的RNA以建立該細胞基因表現的特性，配合機器學習的技術後將型態與電生理的關係鏈結後，第一次得以將神經元的型態、電生理、基因表達全部連結在一起(MET─morphology, electrophysiology, transcription)！
圖四、首先紀錄電生理後，注入染劑，以記錄神經元得外型。接著以機器學習訓練兩者的關聯。再記錄電生理後，萃取RNA以分析基因的表現。接著以機器學習的結果回去找細胞的外型，如此間接的將三者資訊連結在一起。

除此之外，包含影像的腦影像對位技術、開放式的神經元影像重建相關技術的發展(如Vaa3D[8]、Mozak)、神經元型態比對(如NBLAST[9])等，逐漸齊備的工具，讓建立系統性的神經元分類的想法不再是遙不可及的夢想！

首先來簡介艾倫腦科學研究所的新文章，過去的研究顯示根據表達的蛋白質，抑制性神經元可分為主要的四大類─PV+、SST+、VIP+、Htr3a+ /Vip-(=Lamp5)，艾倫腦科學研究所的團隊，兩年前在轉錄體(基因表現)的研究中，又發現了Sncg這種大類型的抑制性神經元[10]，以及60種更細的抑制性神經元分類(圖五)。
圖五、(A)(B)由單細胞轉錄體的分析，可得五大類的抑制性神經元。(C)(D)五大類神經元以及子類的細胞分布位置。(E)(F)五大類抑制性神經元的各種基因的表達量

在本篇研究中，他們嘗試結合神經元的外型、轉錄體(基因表現)、電生理特性，以對神經元做更系統性的分類(圖六)。他們分析了4270顆抑制性神經元的基因表現(但分析只用了約3000顆神經元的表現，因為取樣汙染等)，以及517顆神經元的外型(圖七)。他們的數據顯示電生理(圖八)、細胞外型(圖九)和轉錄體是有明顯的對應關係(圖十)，緊接著用這三個因素定義的新的神經元類型，作者以機器學習進行辨識，訓練後的預測準確率約為8成(圖十一)。因此這三者因素彼此有相關性、各自有連續變化的多樣性，但仍能有明顯的區隔。
圖六、圖像式摘要，本篇研究結合外型(Morphology)、電生理(Eletrophysiology)、轉錄體(transcriptome，也就是基因表現)，對細胞進行分類(MET, morphology + electrophysiology + transcriptome)。

圖七、細胞的轉錄體分析以PCA進行分析後的結果。由於patch-seq會有mRNA流失、污染的問題，作者將數據回去對應到過去的研究(FACS)，以用更好品質的基因表現數據進行分析，可看到不同類型的神經元有各自的分布。

圖八、細胞電生理特性的分析結果，在PCA分析後，可看到不同類型的抑制性神經元有各自的電生理特性。

圖九、神經外型的分析，這邊的「外型」包含其樹突、軸突、細胞本體在大腦六層皮質中的位置分布。

圖十、從轉錄體的分析(y軸)，可分別對應到從外型和電生理分類出的神經元(x軸)。

圖十一、利用機器學習，可以預測所得的細胞是屬於哪種神經元類型

圖十二、以MET作為分類依據，PV+抑制性神經元的子類。左上為細胞本體(神經元左側的box plot)和軸突(神經元右側的分布曲線)的分布。左下為神經元的電生理特性。中間上方和右上方的子圖為神經的基因表達。中間下方和右下方的子圖為電生理的特性。詳細的說明請參閱原始文章。

另一方面，Andreas Tolias等人則分析老鼠動作皮質(motor cortex)的神經元。在266隻老鼠中紀錄了2000顆神經細胞的全細胞電位紀錄(whole cell recording)，其中分析1329顆細胞，以及重建646顆神經細胞的外型。他們分析了抑制性的神經元以及興奮性的神經元的基因表達(圖十三)，同樣的發現在電生理的空間，能和轉錄體的分類資訊吻合(圖十四)。當同時考慮型態和電生理時，能更好的匹配轉錄體的分類資訊(圖十五)。
圖十三、在由統計機率映射後的轉錄體的空間中，不同類型的神經元有各自的基因表達，本篇將Patch-seq所得的資訊(三角形、圓形等標誌)匹配到過去所建立的空間上。

圖十四、經由統計分析將轉錄體的資訊以及電生理的資訊投射到較低維度的空間，可看到不同族群的神經有清楚的對應關係。

圖十五、以轉錄體分類的結果，將電生理(a)型態(b)、以及兩者同時結合(c)的數據進行標示，可看到不同類型的神經在這兩個空間上也有一定的區隔。(d)同時結合電生理和型態的特性後，能更好的區分神經元種類。

簡言之，這篇研究的結果就像他們在討論中所言─「皮質神經元細胞的分類樹就像一顆香蕉樹，有幾個大的葉子，而不是有很多小葉子的橄欖樹」─也就是說從構造、電生理、基因表現三個方面，神經元雖然都具有廣泛的多樣性，以及連續性的變化，但在大分支間彼此是有明顯的差異，儘管不一定能有明顯的邊界！而這三方面彼此也都有關聯性！

總結兩篇的研究內容，大腦神經元儘管多樣性高，但在電生理、基因表達、型態上卻有一致性的對應關係。目前的研究距建立完整的”週期表”或完整的”分類演化樹”仍有不小距離。或許這三個方面的資訊仍不足，也許還需要加入連結模式、發育、更有效的神經外型的描述參數等。若讀者有興趣，也許能思索下一步要怎麼做才能做更好的分類！


撰文者：強敬哲


參考資料：
神經元分類樹的描述原文：
 “We therefore suggest that the ‘tree of cortical cell types’ may look more like a banana tree with a few large leaves, rather than an olive tree with many small ones. In this metaphor, neurons follow a hierarchy consisting of distinct, non-overlapping branches at the level of families (large leaves), but with a spectrum of cells forming continuous and correlated transcriptomic and morpho-electrical landscapes within each leaf.”….[2]

Allen brain atlas (可下載細胞型態、電生理的數據)

神經元週期表的簡介影片(from Allen institute)


中間神經元的”週期表”
1. Gouwens, N. W., Sorensen, S. A., Baftizadeh, F., Budzillo, A., Lee, B. R., Jarsky, T., ... & Bertagnolli, D. (2020). Integrated morphoelectric and transcriptomic classification of cortical GABAergic cells. Cell, 183(4), 935-953.
中間神經元的分類樹
2. Scala, F., Kobak, D., Bernabucci, M., Bernaerts, Y., Cadwell, C. R., Castro, J. R., ... & Mulherkar, S. (2020). Phenotypic variation of transcriptomic cell types in mouse motor cortex. Nature, 1-7.
3. Ramón, S. (1899). Textura del sistema nervioso del hombre y de los vertebrados: estudios sobre el plan estructural y composición histológica de los centros nerviosos adicionados de consideraciones fisiológicas fundadas en los nuevos descubrimientos (Vol. 1). Moya.
電生理與神經元型態的同時記錄
4. Jiang, X., Shen, S., Cadwell, C. R., Berens, P., Sinz, F., Ecker, A. S., ... & Tolias, A. S. (2015). Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex. Science, 350(6264).
5. Barth et al.; Comment on “Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex”; Science (2016)
6. Jiang et al.; Response to Comment on “Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex”; Science (2016)

Patch-seq
7. Cadwell, C. R., Palasantza, A., Jiang, X., Berens, P., Deng, Q., Yilmaz, M., ... & Sandberg, R. (2016). Electrophysiological, transcriptomic and morphologic profiling of single neurons using Patch-seq. Nature biotechnology, 34(2), 199-203.
8. Peng, H., Bria, A., Zhou, Z., Iannello, G., & Long, F. (2014). Extensible visualization and analysis for multidimensional images using Vaa3D. Nature protocols, 9(1), 193-208.
9. Costa, M., Manton, J. D., Ostrovsky, A. D., Prohaska, S., & Jefferis, G. S. (2016). NBLAST: rapid, sensitive comparison of neuronal structure and construction of neuron family databases. Neuron, 91(2), 293-311.
10. Tasic, B., Yao, Z., Graybuck, L. T., Smith, K. A., Nguyen, T. N., Bertagnolli, D., ... & Penn, O. (2018). Shared and distinct transcriptomic cell types across neocortical areas. Nature, 563(7729), 72-78.

註一、可參考筆者2017年所寫的<初窺大腦神經網路的連接規則！？─一場學術界的爭論>

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